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瘦肉精检测原理及操作步骤,己烯雌酚残留的酶

2019-08-16 01:47

一、瘦肉精的测定原理

除非另有说明,在分析中仅使用确认为分析纯的试剂和蒸馏水或去离子水或相当纯度的水。

四、储存条件

B.7.3 加入50mL稀释后的DES抗体到每一个微孔中,充分混合并在2℃~8℃孵育过夜(注意:在第二早上继续进行实验之前,微孔板应在室温下放置30 min以上,稀释用缓冲液也应回到室温,因此最好将缓冲液放在室温下过夜)。

发色剂有任何颜色表明已变质,应当弃之。0标准的吸光值小于0.6时,表示试剂可能变质。

测定的基础是利用抗体抗原反应。微孔板包被有针对兔IgG的羊抗体,加入DES抗、标准和样品溶液。DES与DES抗体连接,同时DES抗体与羊抗体连接。洗涤步骤后,加入DES酶标记物,DES酶标记物与孔中未结合的DES抗体结合,然后在洗涤步骤中除去未结合的DES酶标记物。将酶基质和发色剂加入到孔中并孵育;结合的酶标记物将无色的发色剂转化为蓝色的产物。加入反应停止液后使颜色由蓝变为黄,在450 nm处没量,吸光度与样品的己烯雌酚浓度成反比。

RIDAC18柱纯化样品必须在室温条件下,并严格控制过柱时流速。用3 ml甲醇洗涤柱子,控制流速为1滴/s。用2ml洗涤液(50 mmol/L磷酸二氢钾缓冲液pH 3.0),洗涤柱子。肝脏、肉样的全部上清液进柱,控制流速为1滴/4s。用2 ml洗涤液(50 mmol/L磷酸二氢钾缓冲液pH 3.0),洗涤柱子,流速为1滴/s。用正压除去残留的流体并用空气或氮气吹2 min,干燥柱子。用1 ml甲醇洗脱样品,控制流速1滴/4s。在50-60℃并在弱空气或氮气流下完全蒸发甲醇溶剂。用1 ml蒸馏水溶解干燥的残留物,取20μl进行分析。

B.4 仪器

试剂盒保存于2-8℃,不要冷冻。不用的微孔板放进原锡箔袋中并且与干燥剂一起重新密封。标准物质和无色的发色剂对光敏感,避免直接暴露在光线下。

B.4.6 RIDA C18柱等。

甲醇、50 mmol/LHCL、10 mmol/LHCL、50 mmol/L磷酸二氢钾缓冲液、500 mol/L磷酸二氢钾缓冲液、1 mol/LNaOH。

A0——0标准的吸光度值。

3、饲料

E——吸光度值,%;

二、试剂盒的组成

B.5.3 二氯甲烷。

粉碎的5g样品与25ml50 mmol/L HCL混合,振荡1.5 h,以达到均质的目的。称6g均质物,加入离心管中。10-15℃条件下4000转/min或更高的转速离心15 min。转移上清液到另一个离心管中,加300μl 1mol/L NaOH混合15 min。加入4 ml 500 mmol/L磷酸二氢钾缓冲液,简单混合并在4℃保存至少1.5 h或过夜。10-15℃条件下4000转/min或更高的转速离心15 min。分离全部上清液(应是清亮的,非常重要),使其升至室温,然后用RIDAC18柱纯化。

B.6.1 取5.0 g肌肉,用10 mL pH为7.2的67 m mol/L磷酸缓冲液研磨后,用8 mL叔丁基甲基醚提取研磨物,强烈振荡20 min;离心10 min;移去上清液,用8 mL叔丁基甲基醚重复提取沉淀物。

2、试剂

B.7.6 倒出孔中的液体,将微孔架倒置在吸水纸上拍打以保证完全除去孔中的液体,用250mL蒸馏水充入孔中,再次倒掉微孔中液体,再重复操作一次。

尿样一般不用处理,取20清亮尿样直接测定。如果尿样混浊要过滤或离心至得到清亮尿样。

B.7 测定程序

1、尿样

图片 1···············

五、试剂变质的迹象

B.6 样品处理

2、肝脏、肉样

B.4.4 移液器。

微孔板酶标仪、均质器、冷冻离心机、离心管、微量可调移液器、RIDAC18柱、滤纸(0.45μm)。

B.4.2 离心机。

“瘦肉精”克仑特罗竞争酶标免疫检测方法快速测定的基础是抗原抗体反应。酶联板的微孔包被有针对兔抗克仑特罗特异性抗体的羊抗体。加入兔抗克仑特罗特异性抗体与第二抗体结合而被固定,洗涤后加入标准液或样品溶液与酶结合物,标准液或样品中的游离抗原与酶标抗原竞争兔抗克仑特罗特异性抗体上有限的结合位点。通过洗涤除去没有与特异性抗体结合的酶标抗原,加入酶基质和发色剂并孵育,结合到板上的酶标记物将无色的发色剂转化为蓝色的底物。加酸终止反应后,颜色由蓝色转变为黄色。在单波长 450 nm处测吸光度,吸收光强度与样品中的克仑特罗浓度成反比。

B.5.1 叔丁基甲基醚。

取10g饲料样品,用10 mmol/LHCL溶解,连续震荡10 min,用滤纸过滤,在滤液中加入120μl 1mol/L NaOH进行中和,检查pH,用NaOH控制PH值在6.5-7.5之间,取上清液20μl进行分析。稀释倍数为25(即含有0.04 g饲料样品/ml)。

B.1 适用范围

图片 2

B.5 试剂和标准溶液

1、 设备

B.7.7 加入50mL基质和50mL发色试剂到微孔中,充分混合并在室温暗处孵育15 min。

三、试验材料

B.5.5 乙酸钠缓冲液等。

六、样品处理

B.5.6 提供的DES标准液为直接使用液,浓度为0、12.5×10–9mol/L、25×10–9mol/L、50×10–9mol/L、100×10–9mol/L、200×10–9mol/L。

每个盒中材料如下:

B.7.2 加入20mL的标准和处理好的样品到各自的微孔中,标准和样品做两个平行实验。

1×96孔板(12排×8孔),包被有第二抗体;6个标准液为克仑特罗水溶液。浓度分别为0 ng/kg、100 ng/kg、300 ng/kg、900 ng/kg、2700 ng/kg、8100 ng/kg;1个克仑特罗过氧物酶标记物浓缩液12 ml1个克仑特罗抗体浓缩液12 ml1个酶基质/发色剂11 ml1个反应停止液,1 mol/L硫酸14 ml1个缓冲液25 ml,酶标记物及抗体浓缩液稀释用。

本方法适用于测定水产品肌肉等可食组织中己烯雌酚的残留量。

所获得的标准和样品吸光度值的平均值除以第一个标准的吸光度值再乘以100,得到以百分比给出的吸光度值,以式表示:

B.7.5 加入5mL稀释的酶标记物到微孔底部,室温孵育1 h。

B.4.3 37℃恒温箱。

B.4.5 50mL,100mL,450mL微量加液器。

B.7.1 将足够标准和样品所用数量的孔条插入微孔架,标准和样品做两个平行实验,记录下标准和样品的位置。

B.8 结果

B.7.8 加入100mL反应停止液到微孔中,混合好在450 nm处测量吸光度值,以空气为空白,必须在加入停止液后60 min内读取吸光度值。

A——标准或样品的吸光度值;

B.4.1 微孔酶标仪。

B.6.3 蒸发甲醇溶液,用1 mL二氯甲烷溶解后,再用3 mL 1 mol/L的氢氧化钠溶液提取;然后300 mL 6 mol/L磷酸中和提取液,用RIDA C18柱进行纯化。

己烯雌酚检测的下限为1mg/kg。

B.5.2 石油醚。

式中:

B.6.2 将两次提取的醚相合并,并且蒸发;用1 mL甲醇溶解干燥的残留物;用3 mL石油醚洗涤甲醇溶液。

B.3 检测限

B.2 原理

B.7.4 倒出孔中的液体,将微孔架倒置在吸水纸上拍打以保证完全除去孔中的液体,用250mL蒸馏水充入孔中,再次倒掉微孔中液体,再重复操作两次。

中国水产门户网报道

以计算的标准值绘成一个对应DES浓度的半对数坐标系统曲线图,校正的曲线在25 ng/L~200 ng/L的范围内应成为线性,相对应的每一个样品的浓度,可以从曲线上读出。乘以稀释倍数即可得到样品中DES的实际浓度。

B.5.4 6 mol/L磷酸。

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